生物制药综合实验 II 银耳多糖的制备及分析
原理：
1. 多糖的提取方法
生物活性多糖主要有真菌多糖、植物多糖、动物多糖 3 大类。 多糖的提取首先要根据多糖的
存在形式及提取部位，决定在提取之前是否做预处理。 动物多糖和微生物多糖多有脂质包围，一般需要先加入丙酮、乙醚、乙醇或乙醇乙醚的混合液进行回流脱脂，释放多糖。 植物多糖提取时需注意一些含脂较高的根、茎、叶、花、果及种子类，在提取前，应先用低极性的有机溶剂对原料进行脱脂预处理，目前多糖的提取方法主要有溶剂提取法、生物提取法、强化提取法等。
1.1 溶剂法
①水提醇沉法
水提醇沉法是提取多糖最常用的一种方法。 多糖是极性大分子化合物，提取时应选择水、醇等极性强的溶剂。 用水作溶剂来提取多糖时，可以用热水浸煮提取，也可以用冷水浸提渗滤，然后将提取液浓缩后，在浓缩液中加乙醇，使其最终体积分数达到 70 %左右，利用多糖不溶于乙醇的性质，使多糖从提取液中沉淀出来，室温静置 5 h，多糖的质量分数和得率均较高。 影响多糖提取率的因素有：水的用量、提取温度、浸提固液比、提取时间以及提取次数等。 水提醇沉法提取多糖不需特殊设备，生产工艺成本低，安全，适合工业化大生产，是一种可取的提取方法。但由于水的极性大，容易把蛋白质、苷类等水溶性的成分浸提出来，从而使提取液存放时腐败变质，为后续的分离带来困难，且该法提取比较耗时，提取率也不高。
②酸提法
③碱提法
④ 超临界流体萃取法
1.2 酶解法
①单一酶解法
②复合酶解法
1.3 物理强化法
①微波辅助提取法
②超声波辅助提取法
超声波提取是利用超声波的机械效应、空化效应及热效应。 机械效应可增大介质的运动速度及穿透力，能有效的破碎生物细胞和组织，从而使提取的有效成分溶解于溶剂之中；空化效应使整个生物体破裂，整个破裂过程在瞬间完成，有利于有效成分的溶出；热效应增大了有效成分的溶解速度，这种热效应是瞬间的，可使被提取成分的生物活性尽量保持不变；此外，许多次级效应也能促进提取材料中有效成分的溶解，提高了提取率。超声波提取与水煮法醇沉法相比，萃取充分，提取时间短；与浸泡法相比，提取率高。
③高压脉冲法
2. 多糖的分离纯化
2.1 除蛋白
①Sevage 法
根据蛋白质在氯仿等有机溶剂中变性的特点，用 V（氯仿）∶V（戊醇或正丁醇）为 5∶1 或 4∶1，混合物剧烈振摇 20～30 min，蛋白质变性生成凝胶，离心分离，分去水层和溶剂层交界处的变性蛋白质。 此种只能除去少量蛋白质，效率不高，须反复多次，多糖有损失。 但此方法比较温和，在避免多糖降解上效果较好，如配合加入一些蛋白质水解酶，用 Sevage 法效果更佳。 此法不能除去脂蛋白，因为脂蛋白溶于氯仿。
②三氟三氯乙烷法 ③三氯乙酸法
2.2 多糖的分离
①分级沉淀法
大多数活性多糖可溶于水，3 个碳以下的多糖还可溶于乙醇，随着聚合度的增大，多糖在乙醇中的溶解度逐渐降低。根据这一性质可在多糖的浓缩水溶液中分批加入乙醇，使乙醇的体积浓度逐渐增加，从而使不同聚合度的多糖分别沉淀析出。
②季铵盐沉淀法
黏多糖与一些阳离子表面活性剂（如 CTAB）可以结合形成季铵盐络合物，这些络合物在低离子强度溶液中不溶，在高离子强度溶液中会发生解离，二次醇沉后可提高产物中黏多糖的含量。
③色谱分离
④膜分离法
3 多糖的分析鉴定
①含量的测定
测定方法：硫酸－苯酚法、蒽酮－硫酸法（总糖）、DNS 法（还原法）、离子交换色谱法、HPLC 法、凝胶电泳法、亲和电泳法、次亚碘酸盐定量法、磷钼比色法、邻钾苯胺比色法等。每种方法只对某些多糖的测量效果好。比色法、分光光度法、离子交换色谱法、酶法和电泳法等可同时用于多糖的定性定量分析。蒽酮法测定可溶性糖含量的原理： 糖类在较高温度下可被浓硫酸作用而脱水生成糠醛或羟甲基糖醛后，与蒽酮(C14H10O)脱水缩合，形成糠醛的衍生物，呈蓝绿色。该物质在 620 nm 处有最大吸收，在 150 µg/mL 范围内，其颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。这一方法有很高的灵敏度，糖含量在 30 µg 左右就能进行测定，所以可做为微量测糖之用。一般样品少的情况下，采用这一方法比较合适。
②纯度鉴定
多糖是高分子化合物，其纯品微观上是不均一的，通常所说的多糖纯品实质上是一定分子量范围的均一组分。 多糖纯度鉴定的常用方法：超离心、高压电泳、凝胶层析、HLPC 法等。 现在应用较多的是 HLPC 法，旋光度测定也是纯度测定的一种方法。
③分子量的测定
④结构测定
试剂：
1. 银耳
2. 1% CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）
3. 无水乙醇
4. 1mol/L CaCl2
5. 葡萄糖标准液：0.1 mg/mL
6. 蒽酮试剂：0.2 g 蒽酮溶于 100 mL 浓 H2SO4 中。当日配制使用。
实验步骤：
1. 原料干燥称重，每10g 加入 800mL 水，沸水浴超声加热 8h，纱布过滤收集清液。
2. 加入 1/4 体积氯仿-正丁醇溶液，摇匀，3000rpm 离心 10min，小心收集上清液（无氯仿，省略）
3. 加入 3 倍体积 95%乙醇，搅拌均匀，4 ℃ 3000rpm 离心 5min（或直接用玻璃棒搅拌收集絮状多糖），无水乙醇洗涤沉淀 1 次，至于称过重量的表面皿上干燥。
4.收集银耳多糖粗品，干燥称重。计算粗品得率=（总质量-表面皿质量）/（初始体积*10/800）
5. 取粗品，称量后配置成 1%水溶液，小心倒出上清，去除不溶物，吸取1mL备用，其余上清液加 1/5体积 1%CTAB，沉淀完全，摇匀静置 30min，3000rpm 离心 5min 收集沉淀
6. 沉淀加入 20 mL 1mol/L CaCl2，解离2-3h，3000rpm 离心 10min 收集上清
7. 上清中加入 3 倍体积乙醇，搅拌均匀，4 ℃ 3000rpm 离心 5min（或直接用玻璃棒搅拌收集
絮状多糖），无水乙醇洗涤沉淀1次，至于称过重量的表面皿上干燥。干燥得银耳多糖精品，计算回收率=（总质量-表面皿质量）/粗品多糖质量
8. 纯度测定（根据情况选做）蒽酮法测定总糖含量，计算获得多糖含量
1）葡萄糖标准曲线的制作
取 7 支大试管，按下表数据配制一系列不同浓度的葡萄糖溶液：
在每支试管中立即加入蒽酮试剂 4.0mL，迅速浸于冰水浴中冷却，各管加完后一起浸于沸水浴中，管口加盖，以防蒸发。自水浴重新煮沸起，准确煮沸 l0 min 取出，用冰浴冷却至室温，在 620 nm波长下以第一管为空白，迅速测其余各管吸光值。以标准葡萄糖含量（mg/mL）为横坐标，以吸光值为纵坐标，作出标准曲线。
2）样品中可溶性糖的提取：
将样品 105 ºC 烘干至恒重，精确称取 0.1 g，加水 100mL（1 mg/mL） ，或者将之前备用的1%多糖稀释十倍
3）稀释：吸取上一步糖液 1 mL，加水19 mL（0.05 mg/mL），以蒸馏水稀释定容，摇匀。
4）测定
吸取 1 mL 已稀释的提取液于试管中，加入 4.0 mL 蒽酮试剂；以等量蒸馏水取代糖液作为空白对照。以下操作同标准曲线制作。根据 OD620 平均值在标准曲线上查出葡萄糖的浓度（mg/mL）。
9.计算纯度
