基于CRISPR/Cas9的精准基因治疗利器——单碱基编辑技术
上期CRISPR系统专题内容重点介绍了基于CRISPR/Cas9系统和细胞同源重组修复机制（HDR）的基因编辑技术，该技术可以通过不同的Donor模板实现基因组点突变、大片段敲入，在基因点突变遗传病研究方向展现出巨大的应用潜力。但该技术也存在同源重组效率不高、容易出现非同源重组产生不可预知的突变类型等问题，自此更简便、高效且精准的单碱基编辑技术应运而生，今日小恒便给大家盘点一下单碱基编辑器的种类及相应工作原理。目前开发的单碱基编辑系统主要包括胞嘧啶碱基编辑器（CBE）、腺嘌呤碱基编辑器（ABE）、鸟嘌呤碱基编辑器（GBE）和先导编辑器（Prime Editor）。
胞嘧啶碱基编辑器（CBE）[1]
CBE的核心组成元件是nCas9或dCas9和胞嘧啶脱氨酶，Cas9蛋白与胞嘧啶脱氨酶组成融合蛋白。具体工作原理：当融合蛋白在sgRNA的引导下靶向基因组DNA时，胞嘧啶脱氨酶可结合到由Cas9蛋白、sgRNA及基因组DNA形成的R-loop区的ssDNA处，将该ssDNA上一定范围内的胞嘧啶(C)脱氨变成尿嘧啶(U)，进而通过DNA复制或修复将U转变为胸腺嘧啶（T），最终实现C/G碱基对至T/A碱基对的直接替换。由David Liu实验室开发的CBE经历了四代升级，第四代胞嘧啶碱基编辑器：rAPOBEC1-XTEN-nCas9-2UGI包含了大鼠的胞嘧啶脱氨酶（rAPOBEC1），突变的Cas9（D10A）—nCas9以及两个尿嘧啶糖基化酶抑制子，实现了编辑效率及精准度的不断提升。
图1 CBE工作原理图（Komor AC et al, 2016）
腺嘌呤碱基编辑器（ABE）[2]
与CBE类似，ABE的融合蛋白由nCas9（D10A）和以大肠杆菌的腺嘌呤脱氨酶TadA为基础人为定向改造而来的腺嘌呤脱氨酶组成。在sgRNA的引导下，融合蛋白靶向基因组DNA时，腺嘌呤脱氨酶结合至ssDNA上，将一定范围内的A脱氨替换为次黄嘌呤(I)，而I在DNA水平会被作为G进行读码与复制，最终实现A/T碱基对至G/C碱基对的直接替换。ABE7.10（ecTadA-ecTadA*-nCas9）是目前效率最高且应用最广的ABE版本，将nCas9与野生型腺嘌呤脱氨酶ecTadA和经过定向进化的腺嘌呤脱氨酶ecTadA*二聚体融合，在人类细胞中编辑效率约为50%，编辑活性窗口可覆盖sgRNA的第4~9位。可保证高精度的碱基替换和较少的插入突变发生，ABE的优化方向主要为提高编辑效率、扩大编辑活性窗口和扩大编辑范围。
图2 ABE工作原理图（Gaudelli NM et al, 2017）
鸟嘌呤碱基编辑器（GBE）[3, 4]
GBE由胞嘧啶脱氨酶、尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG)及nCas9融合组成。在sgRNA的引导下，胞嘧啶脱氨酶将靶标C转化为U→UNG从DNA中消除U并产生无嘌呤/无嘧啶(AP)位点→AP位点的创建，再加上nCas9在DNA非编辑链上的切口，启动DNA修复和复制→导致G在AP位点的有利插入（具体机制尚未被解析），最终导致了C到G的编辑结果[3]。除了通过引入UNG以消除U外，通过在APOBEC1-nCas9的C末端融合了一种碱基切除修复(BER)蛋白-XRCC1，可构建另外一种GBE。一旦APOBEC1诱导DNA序列中C到U的转换，细胞内源性UNG蛋白便通过去除U创以建一个AP位点，之后XRCC1通过招募其他BER蛋白来修复AP位点，导致G成为主要的修复产物[4]。
图3 GBE工作原理图（Molla KA et al, 2020）
先导编辑器（PE）[5]
PE系统同样以CRISPR-Cas9系统为基础，包括pegRNA（Prime Editing Guide RNA）和融合蛋白两个核心部分：pegRNA是在sgRNA的基础上，在其3’末端增加了一段RNA序列，这段序列具有双重角色，一端作为逆转录引物结合位点（Primer Binding Site，PBS），另一端则是能与逆转录酶（RT）结合的逆转录模板（Reverse Transcriptase Templates，RTT），携带着设计的目标点突变或插入缺失突变；融合蛋白是将nCas9（H840A突变型，只切断含PAM的靶点DNA链）与逆转录酶融合获得的新型蛋白。
PE工作原理：在pegRNA的引导下，nCas9切断含PAM的靶点DNA链，断裂的靶DNA链与pegRNA的3’末端PBS序列互补并结合，之后逆转录酶发挥功能，沿RT模板序列开始逆转录反应。反应结束后DNA链的切口处会形成处在动态平衡的不成双链的5’-flap和3’-flap结构，其中3’-flap结构的DNA链携带有目标突变，而5’-flap结构的DNA链则无任何突变。细胞内5’-flap结构易被结构特异性内切酶识别并切除，之后经DNA连接和修复后靶位点处便实现了精准的基因编辑。
图4 PE工作原理图（Anzalone AV et al, 2019）
单核苷酸突变是大约2/3人类遗传病发生的原因，也是许多动植物重要性状变异的遗传基础。单碱基编辑技术基于CRISPR/Cas9系统，在不产生双链断裂的前提下，对DNA的单个碱基进行替换，从而达到基因组位点矫正的效果。因为不产生DSB现象，故此出现碱基插入、缺失或移码等非目标突变的情况会大大降低，因而具备高效且精准的基因编辑能力，对于单碱基突变导致的疾病具有重大意义。汉恒专营工具病毒十余载，可定制用于基因敲入的质粒以及病毒工具等产品，如有技术问题或产品订购需求，欢迎随时咨询！
参考文献：
[1] Komor AC, Kim YB, Packer MS, Zuris JA, Liu DR. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature. 2016 May 19;533(7603):420-4.
[2] Gaudelli NM, Komor AC, Rees HA, Packer MS, Badran AH, Bryson DI, Liu DR. Programmable base editing of A•T to G•C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature. 2017 Nov 23;551(7681):464-471.
[3] Zhao D, Li J, Li S, Xin X, Hu M, Price MA, Rosser SJ, Bi C, Zhang X. Glycosylase base editors enable C-to-A and C-to-G base changes. Nat Biotechnol. 2021 Jan;39(1):35-40.
[4] Chen L, Park JE, Paa P, Rajakumar PD, Prekop HT, Chew YT, Manivannan SN, Chew WL. Programmable C:G to G:C genome editing with CRISPR-Cas9-directed base excision repair proteins. Nat Commun. 2021 Mar 2;12(1):1384.
[5] Anzalone AV, Randolph PB, Davis JR, Sousa AA, Koblan LW, Levy JM, Chen PJ, Wilson C, Newby GA, Raguram A, Liu DR. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature. 2019 Dec;576(7785):149-157.
[6] Molla KA, Qi Y, Karmakar S, Baig MJ. Base Editing Landscape Extends to Perform Transversion Mutation. Trends Genet. 2020 Dec;36(12):899-901.
