转录组测序/16s/宏基因组等多项技术探究结直肠癌抗肿瘤免疫应答

近日，新乡医学院王辉教授和中国科学院深圳先进技术研究院陈有海教授为共同通讯作者，在 Cancer Immunology Research (IF: 11.151) 期刊在线发表了题为Tumor necrosis factor-α-induced protein 8-like 2 Fosters Tumor-Associated Microbiota to Promote the Development of Colorectal Cancer的研究论文，揭示了免疫调节分子 TIPE2 通过控制肠癌驱动菌群的扩增影响抗肿瘤免疫应答的新机制。

新乡医学院娄运伟副教授和硕士研究生宋苗苗为本文的并列第一作者。欧易生物在本研究中承担了微生物多样性测序、转录组测序及分析工作。

研究背景

结直肠癌（colorectal cancer, CRC）是全球最常见的消化道恶性肿瘤之一。近年来大量研究表明，结直肠癌的发生发展与肠道菌群的改变密切相关并提出了CRC相关“致癌菌群”的观点。通过16S rRNA测序和宏基因组技术发现，CRC患者肿瘤组织中检测出较高含量的具核梭杆菌、大肠埃希氏菌、脆弱拟杆菌、粪肠球菌、解脲链球菌和消化链球菌等菌种，这些“驱动”菌可以通过与宿主免疫细胞相互作用诱导炎症反应、与癌细胞相互作用分泌致癌毒力因子或产生致癌微生物代谢产物来促进肿瘤的生长，然而宿主通过免疫细胞调节肠道菌群进而影响CRC进程的分子机制仍未完全阐明。

TIPE2是近年来小鼠实验性自身免疫脑脊髓炎模型中被发现和克隆的一个新基因，属于TNFAIP8家族的成员。TIPE2在免疫和炎症过程中发挥重要调节作用，但是在肿瘤发生过程中的作用仍存在争议，对其在肿瘤微环境中的表达调节和作用机制仍知之甚少。

研究路线

点击图片查看大图

研究结果

1、TIPE2在CAC中高表达

为阐明TIPE2在肠道稳态和肿瘤发生中的潜在作用，在结直肠癌小鼠模型中检测了其在肿瘤发生过程中的表达变化。与正常结肠组织相比，AOM/DSS诱导的CAC小鼠模型的远端结肠肿瘤组织中TIPE2 mRNA表达明显升高，炎症细胞因子IL17和IL23（阳性对照）也显著升高（Fig1A）。在Apcmice也观察到了类似的结果，这类小鼠携带了一种腺瘤性大肠息肉（Apc）突变，导致主要在小肠内发展为自发肿瘤（Fig1B）。在两种小鼠模型中，TIPE2蛋白水平显著增加（Fig1C-D）。此外，人结直肠癌样本中TIPE2也显著增加（Fig1E）。接着构建携带GFP绿色荧光蛋白的基因敲入小鼠，通过流式发现TIPE2特异性表达于肠道固有层CD45+的免疫细胞，尤其是在CD45+CD11c- CD11b+MHCII-粒细胞群体中表达最高，而非CD45-的肠道上皮细胞或其它基质细胞（Fig1H-I）。利用肿瘤微环境人单细胞测序数据库TISCH发现TIPE2富集于结直肠癌患者的免疫细胞群体。

Fig1 TIPE2在小鼠肠癌模型和人结肠直肠癌中表达增加

RT-qPCR分析Tipe2, Il23p1和Il17a在AOM/DSS诱导CAC小鼠模型和Apcmice中的表达（A and B）；WB分析其在CAC小鼠模型、Apcmice和3对结直肠肿瘤(T/N)组织中的表达（C, D and E）；GFPpopulations免疫细胞亚群分析（F, H and I）。

2、TIPE2缺陷可减轻由炎症诱发的CAC肿瘤发生发展

进一步探究了TIPE2在AOM/DSS小鼠结肠癌发病机制中的潜在作用。由于高死亡率，将DSS剂量降低到2.5%（Fig2A）。经AOM/DSS处理，Tipe2mice表现出显著的体重减轻和加速恢复（Fig2B），且肿瘤明显变小。说明TIPE2在肿瘤发生发展中发挥重要作用（Fig2C-G）。为进一步探究TIPE2是否是通过髓系系统来影响小鼠肠癌进程的，构建了四组小鼠骨髓嵌合体模型，WT‎‎‎‎‎ >Tipe2, WT >WT ,Tipe2 >WT ,Tipe2 >Tipe2，诱导小鼠实验性肠癌，结果表明，TIPE2是通过髓系系统调节肠癌发生过程的（Fig2H-K）。

Fig2 TIPE2缺失可降低肿瘤发生的易感性

AOM/DSS处理过程中生存曲线分析（A）；Tipe2mice体重、病理、结肠肿瘤数量、肿瘤负荷、肿瘤大小分布结果（B-G）；四组小鼠骨髓嵌合体模型小鼠macroscopic images、病理、结肠肿瘤数量、肿瘤负荷结果（H-K）。

3、TIPE2缺陷降低了Apcmin/+模型的死亡率和肿瘤负荷

结直肠癌中TIPE2表达与患者生存率密切相关（Fig3A）。80%以上结直肠癌患者表现出APC基因突变，因此构建了Apmice用于研究。与ApcTipe2mice相比，ApcTipe2mice的生存时间增加，体重显著增加；在TIPE2缺陷的远端小肠和结肠中肿瘤数量和肿瘤负荷均显著减少（Fig3B-G）；表明缺失TIPE2可以抑制小肠和结肠的肠道肿瘤发生。

Fig3 TIPE2缺失可降低肿瘤发生率

Human Protein ATLAS database中患者生存曲线分析（A）；ApcTipe2和ApcTipe2mice的生存时间、体重、macroscopic images、结肠肿瘤数量、肿瘤负荷结果（B-G）。

已知炎症在癌症发生发展过程中扮演着重要的角色，炎癌转化是很多疾病恶化的罪魁祸首。流式检测了小鼠肠炎相关肠癌早期炎症阶段肠道组织中炎性细胞的群体变化，用7-AAD区分死活细胞以CD45+ CD11b+标记髓系细胞，实验结果显示，TIPE2缺失后，死亡的髓系细胞明显减少；紧接着采用Q-PCR技术检测了炎症相关的信号分子，发现促炎因子的mRNA水平降低。表明TIPE2缺失后可以抑制肠癌早期的炎症阶段。

4、TIPE2缺陷可改善炎症相关的菌群失调

肠道炎症常与肠道菌群失调有关，16S rRNA测序分析了WT和Tipe2mice的肠道菌群组成。在Tipe2mice中变形菌门（Proteobacteria）丰度下降，其中变形菌门中的肠杆菌科（Enterobacteriaceae）显著下调表达（Fig4A-C）。在特定条件下培养大肠杆菌（E. coli），经CAC诱导后E. coli扩张（Fig4D）。经DSS处理，变形菌门、肠杆菌科和大肠杆菌表现出过度生长（Fig4E-F）。这些结果表明：TIPE2缺陷可改善与炎症相关的肠道菌群失调。

Fig4 TIPE2缺陷可改善炎症相关的肠道菌群失调

WT和Tipe2mice的肠道菌群组成、PCoA、family level表达分析（A-C）；E. coli特定条件下培养；QPCR分析Proteobacteria phylum, Enterobacteriaceae family, E. coli, and Lactobacillus species在intestinal luminal specimens (E) or colon mucosal surface (F)中的表达。

为了进一步研究TIPE2在肿瘤发生过程中的作用机制，通过RNA-seq分析比较AOM/ dss处理和未处理小鼠的结肠转录组。AOM/DSS untreated WT和Tipe2mice中鉴定到1791个上调基因和1338个下调基因，差异基因主要富集在免疫相关的pathway（如cytokine–cytokine receptor interaction等）（Fig5A-C）。AOM/DSS WT和Tipe2mice中鉴定到382个上调基因和73个下调基因，差异基因主要富集在inflammation-associated small-molecule biosynthesis and carcinogenesis pathways（Fig5D）。

Fig5 Tipe2mice表现出不同的转录组变化

WT和Tipe2mice结肠组织中0天和90天的差异基因变化（A）；AOM/DSS untreated WT和Tipe2mice差异基因的KEGG富集结果和差异基因表达（B-C）；AOM/DSS treated WT和Tipe2mice差异基因的KEGG富集结果（D）。

Tipe2mice与WT 的粪便16s rRNA结果表明：Tipe2mice与WT分别聚集在一起，表明Tipe2mice的微生物群组成发生了变化，肠杆菌科（Enterobacteriaceae）和大肠杆菌-志贺氏菌（Escherichia-Shigella）在Tipe2mice中显著下调表达（Fig6A-F）。

Fig6 Tipe2mice肠道菌群发生了变化

WT和Tipe2mice粪便PCoA分析（A）；family和genus的菌群表达分析（B和E） ；粪便样本Enterobacteriaceae和Escherichia-Shigella的定量分析（C和F）；结肠组织中p-H2A.X的蛋白水平分析（D）。

5、结肠微生物群在肿瘤发生中的作用至关重要

FMT结果表明：Tipe2mice肠道菌群的改变可以抑制CAC的发生发展。接下来采用抗生素处理来清除肠道菌群进行功能研究，抗生素处理后可抑制肿瘤形成、降低肿瘤数量和肿瘤负荷（Fig7A-D）。流式分析显示了骨髓细胞的浸润，如巨噬细胞和中性粒细胞；此外，免疫相关基因Il17a, Il22, Il23p19 and ccl2表达水平显著下降（Fig7E-I）。

Fig7 Tipe2mice肠道菌群在肿瘤发生发展中至关重要

抗生素清除后，Tipe2和WT mice的病理变化（A-D）和免疫细胞分析（E-H）以及免疫相关基因的定量分析（I）。

研究结论

在这项研究中，首先发现TIPE2在小鼠肠道肿瘤和人结直肠癌组织中表达升高，通过数据库发现TIPE2高表达与结直肠癌患者的低生存率密切相关。对于小鼠肠癌的影响在两种小鼠结直肠癌模型即化学诱导的小鼠肠癌模型和小鼠自发肠癌模型中，发现TIPE2缺陷抑制了结直肠癌的发生发展。通过16S rRNA测序发现肿瘤相关的microbiota（Enterobacteriaceae/E. coli）存在显著差异。为了进一步确认microbiota在肠癌进程中的作用，通过co-housing、抗生素清除和粪菌移植实验证实TIPE2通过控制microbiota诱导的炎症反应调节肠道肿瘤的生长过程。

综上所述，利用生物信息学分析、临床样本和动物模型揭示了TIPE2能够通过调控肿瘤相关microbiota的扩增促进结直肠癌的发生发展，为肠道肿瘤免疫治疗提供新的潜在靶点。

原文链接：https://doi.org/10.1158/2326-6066.CIR-21-0666

猜你想看

• 2022年了，单细胞技术课题设计早已没那么简单 | 内有福利

• 空间转录组项目疑虑多？小欧为您来解惑~

• 项目文章 | 山东大学王显伟团队发现对虾抵抗细菌感染的新机制

• 项目文章 | 欧易生物单细胞转录组测序教你如何挖掘lncRNA数据！
  

本文系欧易生物原创