SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）

SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）

SDS-PAGE 的目的是根据蛋白质的大小而不是其他物理特征来分离蛋白质。为了理解这是如何工作的，我们必须理解名称的两半：SDS 和 PAGE。

SDS

由于我们试图分离许多不同形状和大小的不同蛋白质分子，我们首先希望它们变性，以便蛋白质不再具有任何二级、三级或四级结构。分子的 3D 结构将决定它在环境中移动的能力。我们使用 SDS 将所有蛋白质变性为相同的线性形状。

图 1.该图的顶部显示了由于蛋白质中带电的 R 基团而具有负电荷和正电荷的蛋白质。 大的 H 代表疏水域，非极性 R 基团聚集在疏水域中，以试图摆脱蛋白质周围的极性水。 下图显示 SDS 可以破坏疏水区域并用许多负电荷包裹蛋白质，这些负电荷压倒了蛋白质由于带正电荷的 R 基团而具有的任何正电荷。 所得蛋白质已被 SDS 变性（还原为其一级结构），因此已被线性化。

SDS（是一种洗涤剂，可以溶解疏水分子，但也带有负电荷（硫酸盐）。 因此，如果用 SDS 孵育细胞，细胞膜会溶解，所有的蛋白质都会被去污剂溶解，而且所有的蛋白质都会被许多负电荷覆盖。

PAGE

如果将蛋白质变性并置于电场中，它们将以相同的速度向正极移动，不会按大小分开。 所以我们需要将蛋白质放入一个允许不同大小的蛋白质以不同速率移动的环境中。 选择的环境是聚丙烯酰胺，它是丙烯酰胺单体的聚合物。 当这种聚合物形成时，它会变成凝胶，我们将用电将蛋白质拉过凝胶，因此整个过程称为聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)。 聚丙烯酰胺凝胶是由穿过纤维网状结构的迷宫般的隧道构成（图 2 和图 3）。

图 2. 展示了一块聚丙烯酰胺板（深灰色），其边缘暴露有隧道（不同大小的红色环带阴影以描绘深度）。凝胶中随机散布着许多不同大小的隧道。

图 3. 这是两个选定隧道的俯视图。 这些隧道一直延伸穿过凝胶，但它们蜿蜒穿过凝胶，并不呈直线。 注意两个隧道的直径差异。

现在我们将变性蛋白质的混合物施加到凝胶上并施加电流（图 4）。 如果所有的蛋白质同时进入凝胶并且有相同的力将它们拉向另一端，那么哪些蛋白质能够更快地穿过凝胶？显然，小分子可以比大分子更快地穿过聚丙烯酰胺。

图 4. 显示变性蛋白质的混合物开始通过聚丙烯酰胺凝胶。 远端的正极和近端的负极建立电场。 由于所有的蛋白质都带有很强的负电荷，它们都会向箭头所指的方向移动。

当我们处理蛋白质时，我们处理的是每种蛋白质的许多拷贝。蛋白质倾向于成束或带状地穿过凝胶，而且它们的形状和大小都相同。运行 SDS-PAGE 时，我们不能让蛋白质电泳运行太久，以免到达凝胶的另一侧。我们关掉电流，然后对蛋白质进行染色，看看它们在凝胶中移动了多远。图 5 显示卡通凝胶，图 6 显示真实凝胶。请注意，实际条带大小相等，但每个条带内的蛋白质大小不同。

图 5. 电流开启一段时间后然后关闭后 SDS PAGE 的顶视图。 凝胶有五个编号的泳道，其中五个不同的蛋白质样品（每种蛋白质的许多拷贝）被应用于凝胶。 （第 1 道，已知大小的分子量标准；第 2 道，三种不同大小的蛋白质的混合物，a 是最大的蛋白质，c 是最小的蛋白质；第 3 道，蛋白质 a ；第 4 道，蛋白质 b ； 泳道 5 蛋白质 c。）请注意，无论是否与其他蛋白质一起（泳道 2）（泳道 3-5），三种蛋白质中的每组在凝胶中迁移的距离相同。 分子量标准用于测量未知蛋白质（a、b 和 c）的相对大小。

图 6. 这张照片显示了在凝胶上分离的各种不同蛋白质。 此特定图像显示了同一蛋白质样品的连续稀释，以表明需要多少蛋白质才能被检测到。