生信分析和转录组测序，如何开展候选基因功能研究？
大家慢慢也发现，纯生信分析或转录组测序，仅挖掘到候选基因是远远不够的。找到关键基因后，全面且系统的基因功能验证方案也是高分SCI浓墨重彩的一部分。
今天小薇给大家分类总结了一下研究关键基因的方法，绝对的干货，快收藏起来！
一、基因表达定量分析
基因表达量验证，目的是为了比较候选基因在特定组织/细胞中与对照组的表达差异是否与前期测序或分析结果一致。
最常见的方法便是qPCR，该方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便快捷以及结果可定量等优点。
二、基因亚细胞定位
亚细胞定位是为了确定目的基因在细胞内的具体位置，包括核内、胞质内或者细胞膜，从而为理解基因的作用机制提供研究方向。常见的研究方法包括：
1、免疫荧光标记
这是一种将免疫反应与化学光学信号结合起来的方法，通过特异性的荧光标记抗体与目标蛋白/抗原结合，进行荧光信号检测，最后利用荧光显微镜观察荧光所在的细胞或组织位置，从而确定目标蛋白定位。
2、GFP融合蛋白表达
该方法将绿色荧光蛋白（GFP）作为报告基因，通过基因工程技术将其与目标蛋白基因进行融合，转染后对报告蛋白的引导信号进行跟踪从而确定目标蛋白的定位。
三、基因功能与疾病表型的关联
该研究方法是将目的基因进行过表达或敲除，平行开展回复实验，观察基因对疾病表型的影响。
1、过表达载体构建
在目的基因上游加入调控原件，使基因可以在人为控制的条件下实现大量转录和翻译，从而实现基因产物的过表达，常用于研究mRNA、lncRNA、miRNA等。
2、基因敲低
基因敲低是指通过降解具有同源序列靶基因的mRNA，达到阻止基因表达的目的。常见的技术包括RNA干扰（RNAi）以及CRISPR-Cas9。
其中，RNAi是双链RNA通过靶向mRNA降解诱导序列特异性基因沉默的生物学过程。介导RNAi效应的方法包括小干扰RNA（siRNA）、短发夹RNA（shRNA），已被广泛应用于转录后敲除单个基因的表达。
CRISPR-Cas9是一种来源于微生物免疫系统的可编程核酸酶。其核酸酶Cas9可由与目标DNA链互补的单一引导RNA（sgRNA）指导，sgRNA通过互补与目标链结合，从而引导Cas9在目标DNA序列上产生位点特异性双链断裂，从而达到对目的基因进行修饰的目的。与RNAi相比，CRISPR产生的脱靶效应更少，并且可以针对整个基因组的编码和非编码区域。
3、疾病表型研究
在过表达/敲低目的基因的基础上，开展体内体外实验观察疾病表型变化（包括增殖、凋亡、周期、侵袭、迁移、自噬、血管生成等）。同时可以平行开展回复实验（比如添加特异性抑制剂或激活剂进行挽救，或对调控下游进行反向干预），观察疾病表型的变化是否被逆转。
四、基因上下游调控机制研究
目的是探究RNA与RNA或RNA与蛋白质之间的上下游调控关系，常见的互作研究方法包括：
1、双荧光素酶报告基因实验
该方法利用荧光素酶与底物结合发生化学发光反应的特点，把感兴趣的基因转录调控元件克隆在萤火虫荧光素酶基因上游，构建成荧光素酶报告质粒。同时，将带有海肾荧光素酶基因的质粒作为对照质粒与报告基因质粒共转染细胞。通过检测荧光素酶活性来识别转录因子与目的基因启动子区域的相互作用。
2、RNA pull-down
该方法利用生物素标记的RNA探针，通过与含有目的蛋白的溶液孵育，形成RNA-蛋白质复合物。该复合物可以特异性结合磁珠，从而与其他蛋白分离。洗脱后，通过蛋白凝胶电泳或WB实验，对下拉的蛋白进行分析。
3、免疫沉淀（IP）
这是一种利用抗原抗体特异性反应纯化富集样品中目的蛋白的一种方法，收集到免疫复合物沉淀后，根据检测目标的不同将其分为CHIP、RIP和CO-lP。
其中，CHIP可捕获与已知蛋白相结合的DNA，随后通过qPCR、基因芯片或者测序等技术对DNA产物进行分析和鉴定。
RIP主要用于分离与目标蛋白可能结合的RNA，纯化后再利用RT-qPCR或测序来探究其转录水平的调控机制。与ChIP实验不同的是，RIP复合物不需要固定，且反应体系中不能包含RNA酶等等。
CO-lP可以用IP级别抗体去下拉所有可能与已知蛋白结合的蛋白，随后利用WB或者MS对产物蛋白进行分析和鉴定。
以上便是小薇总结的对候选基因开展功能研究的常见方法，小伙伴们可根据实验经费和周期的实际情况，挑选合适的研究方法进行组合，来给自己的生信分析或转录组学文章锦上添花~
当然了，如果对这些方法还不熟悉，或者不知道如何来进行挑选和组合以达到理想的目标分值，都可以扫码联系小薇，让我们来给你出谋划策哦！
