看dCas9蛋白如何“玩转”基因组转录调控
多基因通路复杂且动态的转录调控驱动着许多重要的细胞活动，包括基因组复制和修复、细胞分裂和分化以及疾病进展和遗传。了解基因网络的复杂功能需要通过抑制或激活来精确操纵或扰乱靶标基因的表达。众所周知，CRISPR/Cas9技术是基因编辑常用的手段，前面小编对其应用细节做了具体介绍，本期小编为大家带来了自CRISPR/Cas9系统衍生而来的、用于基因转录调控的CRISPR/dCas9系统相关知识。
常规Cas9蛋白有6个结构域，分别是Rec I、Rec II、Bridge Helix、PAM Interacting、HNH和RuvC。Rec I是6个中最大的一个结构域，负责结合sgRNA。一旦结合了靶DNA，Bridge Helix就负责启动剪切。而PAM interacting结构域则赋予Cas9识别DNA上的特异性PAM序列的能力，负责启动与靶DNA的结合。HNH和RuvC都是核酸酶结构域，分别剪切一条DNA链。通过将RuvC（D10A）和NHN（H840A）两个核酸酶结构域分别进行氨基酸突，从而得到一个没有核酸酶活性的Cas9蛋白，使其失去切割DNA的功能，但仍保留结合DNA的能力，这样的Cas9 称之为dCas9（Dead Cas9）。目前CRISPR/dCas9系统常用于基因组转录调控，用以激活或抑制特定基因的表达，从而达到研究基因功能的目的。
图1. Cas9及dCas9工作原理图（图片来源：Dominguez AA et al，2016）
转录抑制（CRISPRi）：通过将 dCas9 与序列特异性 sgRNA 配对，dCas9-sgRNA 复合物可以结合至转录起始位点（TSS）附近，通过物理性阻断 RNA 聚合酶 (Pol) 与靶标DNA结合来干扰靶标基因的转录延伸，还可以通过破坏转录因子的结合来阻碍转录起始，达到基因沉默或减少基因转录的效果。为了进一步提高转录抑制的效率，dCas9可融合某些基因抑制结构域，如KRAB结构域（转录抑制子的保守结构域，可与 DNA 结合蛋白融合以实现靶向转录抑制）。此外，dCas9也可以融合双抑制结构域（bipartite repressor domain）KRAB-MeCP2，抑制效果更佳。一个完整的 CRISPRi系统包含两个部分，sgRNA表达载体和dCas9-KRAB（或者dCas9-KRAB-MeCP2）表达载体。设计基因抑制实验时，只需要设计靶标基因的sgRNA表达载体即可。另外还可将dCas9与四个串联的mSin3相互作用结构域（存在于多个转录阻遏蛋白上的相互作用域，SID4X）或Max相互作用蛋白1（Mxi1）融合表达，同样也被证明具备抑制靶标基因表达的效果。
图2.CRISPRi工作原理图（图片来源：Dominguez AA et al，2016）
CRISPRi系统的优势：不改变内源基因组背景，与CRISPR基因编辑、传统基因敲除技术不同，该系统不会改变靶基因位点基因组序列；强基因抑制效果，使用该系统进行转录抑制通常可以获得高水平的基因抑制效果；更多适用的基因种类，由于dCas9-KRAB CRISPRi系统是在DNA水平抑制基因表达，因此适用于多种转录本，包括mRNA、非编码RNA、microRNA、反义转录本、核定位RNA以及聚合酶III 转录本的转录抑制；特异性，dCas9-KRAB CRISPRi系统可实现高效抑制同时，几乎没有脱靶现象；可以针对不同基因设计多个sgRNA，实现对多个基因的同时抑制。但由于dCas9-KRAB需要接触到靶标基因的调控序列，因此会因为不同基因所处染色体位置不同而产生不同的抑制程度，这取决于它们的内源染色质状态，另外dCas9 可能会抑制操纵子内的下游基因（极性效应）而不是单个基因。
转录激活（CRISPRa）：通过使用dCas9融合蛋白来招募转录激活因子，从而达到靶标基因转录激活或上调的效果。在哺乳动物细胞中，VP64（一种转录激活子，由四个串联拷贝的单纯疱疹病毒VP16激活结构域组成，通过Gly-Ser连接子连接。）、p65激活结构域 (NF-κB转录因子核形式多肽的主要反式激活结构，p65AD) 或Rta47（人类疱疹病毒R反式激活子）与 dCas9 的融合可以通过单个 sgRNA激活靶标基因。通过同时在dCas9的氨基和羧基末端的融合VP64、串联多个不同的转录激活因子或添加了多个 VP16 拷贝可以表现出更强的激活能力。
另外，sgRNA工程改造也被证明可以提高基因激活的效率。通过将蛋白质相互作用RNA适体MS2添加到 sgRNA 中，实现了一种称为协同激活介体 (SAM) 系统的改进： MS2可招募p65AD与热休克因子1(HSF1)融合蛋白。与单独的 dCas9-VP64 相比，SAM 技术与 dCas9-VP64 结合使用，进一步增强了内源基因的激活效率。具体操作过程：向实验细胞共转导两种分别携带dCas9:VP64和MS2:P65:HSF1的表达载体，进行抗性筛选。然后使用递送sgRNA/MS2的第三种表达载体转导细胞，并用另一种抗生素进行筛选，即可达到激活或增强靶标基因表达的目的。
图3. CRISPRa工作原理图（图片来源：Dominguez AA et al，2016）
CRISPRa的优势：与CRISPRi一致，CRISPRa可以激活内源基因组的转录，但不会改变靶基因位点基因组序列；无需预先了解靶标基因的天然调控机理，仅需知晓靶位点DNA序列的准确信息；使用SAM系统进行转录激活的基因通常可以得到较高水平的表达，但该系统需要三个载体共同作用，转染/感染难度相对较大。且目前尚未有sgRNA/MS2RNA靶向特异性的评估的有效方法。
提高转录抑制或激活的sgRNA优化细节：对于CRISPRi，靶向特定基因TSS的-50至+300bp区间可实现强抑制，在TSS下游+50bp至+100bp处可实现最大抑制效果；sgRNA中避免出现连续相同碱基序列（例如TTTT或CCCC）。对于使用多激活因子串联的CRISPRa，当靶向TSS上游-50bp至-400bp的区间时，发现了最佳的基因激活；对于使用SAM系统的激活，最佳靶向区间为TSS的-200bp至+1bp，另外当靶向启动子区域和区域中的转录因子结合点时sgRNA与DNA正义链或反义链结合都具有良好的抑制效果，但靶向启动子区域的下游时只有与非模板链结合才有效。CRISPRi的效率很大程度上依赖于招募的效应复合物与靶基因TSS的结合位置。
CRISPRi和CRISPRa均可通过针对不同的基因设计不同的sgRNA进行批量调控或实现同时激活/抑制某些功能相关的基因，是了解复杂基因网络功能的利器。汉恒专营工具病毒十余载，可提供CRISPRi/CRISPRa的相关质粒以及病毒工具，如有技术问题或产品订购需求，欢迎随时咨询！
参考文献：
[1] Dominguez AA, Lim WA, Qi LS. Beyond editing: repurposing CRISPR-Cas9 for precision genome regulation and interrogation. Nat Rev Mol Cell Biol. 2016 Jan;17(1):5-15. doi: 10.1038/nrm.2015.2.
[2] Gilbert LA, Larson MH, Morsut L, Liu Z, Brar GA, Torres SE, Stern-Ginossar N, Brandman O, Whitehead EH, Doudna JA, Lim WA, Weissman JS, Qi LS. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 2013 Jul 18;154(2):442-51. doi: 10.1016/j.cell.2013.06.044.
[3] Yeo NC, Chavez A, Lance-Byrne A, Chan Y, Menn D, Milanova D, Kuo CC, Guo X, Sharma S, Tung A, Cecchi RJ, Tuttle M, Pradhan S, Lim ET, Davidsohn N, Ebrahimkhani MR, Collins JJ, Lewis NE, Kiani S, Church GM. An enhanced CRISPR repressor for targeted mammalian gene regulation. Nat Methods. 2018 Aug;15(8):611-616. doi: 10.1038/s41592-018-0048-5.
[4] Konermann S, Brigham MD, Trevino AE, Joung J, Abudayyeh OO, Barcena C, Hsu PD, Habib N, Gootenberg JS, Nishimasu H, Nureki O, Zhang F. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 2015 Jan 29;517(7536):583-8. doi: 10.1038/nature14136.
