Western Blot（WB实验）实验解析
Weston Blot
1.实验原理
- 1、检测已知蛋白：
- 一抗和目的蛋白直接特异性结合
- 2、检测未知蛋白：
- 先用标签蛋白His-tag连接未知蛋白
- 二抗带有辣根过氧化物酶，二抗和一抗特异性结合
2.总流程
1.样品制备 分三步
- 需要全程冰上操作
1.1.样品处理：
1.2.裂解:有时会需要检测磷酸化蛋白或去乙酰化蛋白，则相应酶对其影响较大
1.3.蛋白定量
- 意义/目的：不同处理组样品得到的目的蛋白 的电泳上样量需要保持一致
- 细胞蛋白目的蛋白含量较高，组织样品目的蛋白含量较少，实际操作通过“预实验”进行调整
- 定量方法：
- BCA法：如果样品自带螯合剂等干扰产品，则考虑另外的定量方法
- 考马斯亮蓝法：普通型对去垢剂（裂解液）不耐受
2.SDS-PAGE电泳
2.1.原理
- SDS断裂氢键、 破坏蛋白质结构、且与蛋白质成比例结合——带负电荷的SDS-蛋白质复合物（SDS自身带负电）
- 所以电泳时，迁移速度仅取决于分子大小
- 目的蛋白大小与分离胶浓度
2.2.制胶
- 充分凝固（20min+）
- 倒时避免气泡
2.3.样品制备
- 分段电泳
3.转膜
- 膜
- 切角区分正反方向
- 蛋白胶必须放负极，向正极跑
- 手不能接触滤纸（滤纸易与蛋白结合）
- 每一层之间都要防止气泡
- 充分浸润转膜液
- 确定转膜时间根据marker
- 丽春红染色观察转膜效果；但蛋白浓度低时即使染色看不见，曝光仍然可以显影出二抗
4.封闭 注意封闭液
- 封闭时间
5.抗体杂交/孵育--一抗 二抗
常见老鼠、兔子选择单抗效果好
不常见的如菌、组织可以使用多抗
- 洗涤液 一般洗三到五次
- 3次 10min≠1次 30min
- 二抗
6.显色发光
- ECL显色液注意现配现用
总结-注意事项
试剂总结
导致“背景高”的问题＆解决
无条带/信号弱
其他问题
- BCA蛋白定量--双标准曲线
- 分离胶和浓缩胶一般半小时，冬天可适当延长时间
- 封闭时需在摇床上
- weston和elasa相辅相成。weston半粗定量，elasa定量定性
- 倒浓缩胶有气泡，可以倒的时候慢一点，用针将气泡戳掉。
