细胞外基质（ECM）是由胶原蛋白、蛋白多糖、弹性蛋白等组成的三维非细胞网络，几乎存在于所有的组织中。细胞的形状、增殖分化、迁移侵袭及信息传递等过程都与ECM密切相关，异常的ECM蛋白引发纤维生成和肿瘤病变。由于对ECM中不溶性基质蛋白的提取仍然是一个瓶颈，目前对组织中ECM的病理生理组成和变化的了解是有限的。

彻底去除ECM中的细胞成分是表征ECM不溶性基质蛋白图谱的关键。近日，青莲百奥合作客户首都医科大学附属北京友谊医院在《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》上发表了一篇题为“Pipeline for precise insoluble matrisome coverage in tissue extracellular matrices”的研究文章。在这项研究中，提出了使用增强的十二烷基磺酸钠(E-SDS)用于彻底的组织脱细胞及一套完整的流程，用于准确鉴定和定量高度不溶性ECM基质蛋白以了解ECM的蛋白质组特征。

标题：Pipeline for precise insoluble matrisome coverage in tissue extracellular matrices

期刊：Frontiers in Bioengineering and Biotechnology

IF：6.064

时间：2023.05

研究背景

ECM中大多数核心基质蛋白具有较大的分子量并且是共价交联，因此它们也大多不溶且难以提取。目前物理、化学、酶处理及十二烷基磺酸钠(SDS)脱细胞的方法对ECM不溶性基质蛋白无法实现良好的提取，难以实现精确的基质蛋白质组覆盖。

研究思路

本研究通过改进的E-SDS脱细胞方法对小鼠的9种器官进行处理，评估该方法脱细胞的效率、SDS的残留量及胶原的完整性。通过Labelfree定量蛋白质组学技术对不同器官脱细胞基质（dECM）中不溶性基质蛋白质组进行定量及差异比较（青莲百奥提供技术服务）。通过和Baiocchini的SDS方法对比，评估E-SDS脱细胞方法的性能。

研究内容

1.E-SDS方法脱细胞效率高，dECM纯度高

所有经过E-SDS脱细胞的小鼠器官在相对较短的时间内(6 - 48小时)变成白色(脂肪、肝脏、肺和胃)、灰白色(心脏、肾脏和脾脏)或透明(脑和十二指肠)。除脑外，dECM支架在结构上保持了天然器官的形态学和先天显微结构。与天然器官相比，所有脱细胞的器官都失去了常驻细胞特有的绿色，剩余的dECM支架呈现粉红色，表明脱细胞成功，ECM大量富集，细胞碎片很少保留。此外，弹性蛋白染色也证实了脱细胞后弹性纤维的富集。E-SDS具有用于小鼠组织或器官脱细胞的潜力，在dECM支架纯化具有相对较高的效率。

2.采用E-SDS脱细胞技术制备的dECM支架中SDS残留量更低，胶原纤维完整性更高

通过测定天然组织和dECM支架中的核物质。在第一轮脱细胞液中所有组织的DNA含量都很高，而在第二轮脱细胞液中DNA含量急剧下降，说明脱细胞主要发生在第一轮脱细胞。检测dECM支架中SDS的残留量，丙酮沉淀前的dECM支架中SDS残留量较高，而丙酮洗涤后的dECM支架中SDS含量几乎检测不到，说明丙酮具有很强的SDS沉淀能力。通过对胶原蛋白特异性免疫染色的3D重建和扫描电镜分析显示，来自对照组、纤维化组和纤维化消退组小鼠肝脏的dECM支架中胶原纤维的排列和取向得到了很好的保存。

3.小鼠组织的dECM支架中的高度不溶性基质蛋白组分析

采用Label-free蛋白质组学分析揭示小鼠组织中dECM支架中高度不溶性的基质蛋白。9种dECM支架的基质数与总蛋白数之比为32.8% ~ 50.3%。基质蛋白丰度与总蛋白丰度之比从78.5%到96.2%，表明E-SDS方法可以保留更多的细胞外不溶性蛋白，具有用于广泛组织中不溶性基质蛋白的质谱分析的潜力。与之前的报道相比，蛋白多糖在所有小鼠组织中的数量最多，但在所有dECM支架中，胶原蛋白是最丰富的不溶性基质蛋白。

4.不同小鼠组织中不溶性基质蛋白的比较

接下来比较了小鼠组织9种器官中不溶性基质蛋白组成的差异。大多数基质蛋白在所有组织中均表达，而少数蛋白表现出组织特异性。例如，只有肾dECM支架中表达TINAG和MEP1A蛋白；LAMC2、AGRN 和LAMA3蛋白仅在肺dECM支架中发现；TINAGL1和ANXA7蛋白仅在脑dECM支架中发现。除组织特异性外，共有8种胶原蛋白、6种ECM糖蛋白和1种蛋白聚糖在所有组织中以不同的丰度的表达。这些常见的基质蛋白彼此之间高度相互作用，可能构成了小鼠组织中核心的不溶性基质网络。KEGG功能注释分析显示，这些基质蛋白与纤维形成、免疫和增殖等相关，涵盖了dECM支架的生物学功能。

5.E-SDS方法对不溶性基质精确覆盖的性能评价

为了评估E-SDS方法在组织细胞外基质中精确覆盖不溶性基质的性能，比较了使用E-SDS和Baiocchini的SDS方法的dECM支架。使用E-SDS和Baiocchini的SDS方法获得的肝dECM支架中各类别基质成分的数量或丰度存在较大差异；相比之下，E-SDS法处理的肝dECM支架中胶原蛋白和糖蛋白的数量和丰度都占最多。因此E-SDS方法可能能够消除更多的ECM相关蛋白、ECM调节因子和ECM支架中的分泌因子。进一步进行免疫荧光染色以验证LC-MS/MS蛋白质组学的结果，细胞内几乎检测不到GAPDH，表明使用两种SDS方法在肝dECM支架中几乎没有保留细胞碎片；由Baiocchini的SDS法处理在肝dECM支架中鉴定出分泌的LOXL1（ECM调节因子）和MAGP1（ECM糖蛋白），而E-SDS方法则没有；两种SDS方法均可在肝dECM支架中高度富集ECM结构蛋白，如III型胶原、VI型胶原和弹性蛋白。总的来说，E-SDS方法结合蛋白质组学分析可以鉴定和定量组织细胞外基质中高度不溶性的基质蛋白。

总结

该研究提出了一个E-SDS脱细胞的流程，该方法对不溶性基质蛋白的提取纯度和保留率更高，适用于全局不溶性基质蛋白的表征。相比Baiocchini的SDS方法，该方法成本低，操作简单，更适用于不溶性基质蛋白。该研究将为组织不溶性基质分析提供一个低成本、简单、可靠和有效的方法，有助于了解ECM的发现和蛋白质组学研究。