重磅：新型基因编辑工具PASTE，实现定点插入超大片段基因
2023-03-23 11:22 作者:ABclonal-爱博泰克 | 我要投稿
生命科学的飞速发展，为科学家自由操纵基因提供了前所未有的简便和高效。在分子生物学实验室里，你可以很方便地通过聚合酶链式反应（PCR）将一个基因克隆下来，并连接到相应的表达载体（质粒）上。
遗憾的是，上述的分子克隆实验通常是在原核生物中进行的（例如细菌），但涉及真核生物基因组的操作，特别是几千个核苷酸长度的DNA序列的整合，仍然十分具有挑战性。这也限制了合成生物学、细胞工程和基因治疗等新兴领域的发展。
CRISPR-Cas9基因编辑系统，是由Cas9酶（负责切割DNA双链）和gRNA（负责识别和靶向目标基因组特定位点）组成，gRNA引导Cas9到达基因组的特定位点并指导Cas9切割DNA双链。当Cas9和靶向致病基因的gRNA被递送到细胞中时，会切割致病基因的特定位点，造成DNA双链断裂（DSB），细胞随后启动DNA修复过程，但这种修复过程会出现错误，从而实现对致病基因的敲除。
该研究调的希望能开发出一种新工具，能够在不不引起DNA双链断裂的情况下，去除并替换有缺陷的基因。为了实现这一目标，他们将目光放在了整合酶上，这是一类来自病毒（噬菌体）的酶家族，噬菌体利用整合酶将自己的基因组插入到宿主细菌基因组中。
在这项研究中，研究团队专注于丝氨酸整合酶，它可以插入大片段DNA序列，最长可达5万个碱基对。这些整合酶的目标是被称为附着位点的特定基因组序列，它起着“着陆垫”的作用。当整合酶在宿主基因组中找到正确的附着位点时，就会与之结合，然后将携带的DNA片段整合进去。
PASTE技术原理
注：Programmable Addition via Site-specific Targeting Elements（基于位点特异性靶向元件的可编程添加），简称PASTE，PASTE这个词本身有粘贴、插入的意思。
Jonathan Gootenberg 表示，这项研究是实现可编程的DNA大片段插入梦想的一大步，通过这一技术可以很容易地根据需要定制附着位点和整合DNA片段。
从上述技术原理来看，PASTE很容易让人想到刘如谦团队开发的先导编辑（Prime Editor），在先导编辑的Cas9切口酶和逆转录酶的基础上融合了丝氨酸整合酶，相当于使用先导编辑先在基因组中插入丝氨酸整合酶的附着位点，然后通过丝氨酸整合酶来插入大片段DNA。
刘如谦团队开发了升级版的先导编辑（Prime Editor），将其命名为——双先导编辑（Twin Prime Editing，TwinPE）。TwinPE同样不会导致DNA双链断裂，通过一个先导编辑蛋白（prime editor protein）和两个向导RNA（pegRNA），可实现对人类基因组的可编程的大片段DNA的删除、替换、整合和倒位。
在这项研究中，研究团队使用PASTE技术将DNA片段插入了包括肝细胞、T细胞和淋巴母细胞等人类细胞中，研究团队测试了13个不同的DNA片段，其中包括一些具有治疗意义的基因，能够将它们插入到基因组中的9个不同位点。
在这项研究中，研究团队最长插入了36000个碱基对的DNA序列，但他们表示还可以更长。人类基因的碱基对从几百个到200多万个不等，但在治疗中只需要使用其中编码蛋白质的序列，也就是外显子序列即可，这大大减少了所需插入的DNA片段的大小。
2022年10月，弧光研究所（Arc Institute）的 Patrick Hsu 团队在 Nature Biotechnology 期刊发表了题为：Systematic discovery of recombinases for efficient integration of large DNA sequences into the human genome 的研究论文【5】。该研究开发了一种算法识别了数千种丝氨酸整合酶及其DNA附着位点，将已知丝氨酸整合酶的多样性扩大了100倍。这些整合酶可以将超过7kb的大型DNA片段精准、高效地插入人类基因组。
大量识别新的丝氨酸整合酶及其附着位点是利用整合酶进行大片段DNA插入的一种思路，但是绝大部分的丝氨酸整合酶对人类细胞而言是有毒的，这就导致了发现的大部分新的丝氨酸整合酶是不可用的。因此，人为向基因组导入附着位点的方式，能够几乎在基因组的任何位置利用丝氨酸整合酶插入大片段DNA。
据悉，Omar Abudayyeh、Jonathan Gootenberg 于2021年创立了一家名为 Tome Biosciences 的生物技术公司。研究团队正在进一步探索使用PASTE技术来替换有缺陷的囊性纤维化基因的可行性，此外，该技术可以用于治疗许多由基因突变引起的疾病，例如血友病、G6PD缺乏症、亨廷顿舞蹈症等等。
对于大片段DNA的插入或替换而言，CRSIPR-Cas9可能并不是很好的工具，自然界中大量的可移动遗传元件，能够从中不断发现有趣、有用的新工具，是未来值得探索的方向。
