中国药科大学 生物药物分析 第八章 蛋白质药物分析

1、  概念：在结构上属于蛋白质的药物。来源：（1）天然提取；（2）化学合成或半合成；（3）现代生物技术制备。

2、  生物技术药物：生物技术药物是指有现代生物技术手段，如基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程、蛋白质工程等技术制备生产的药物。

3、  蛋白质药物结构特点：蛋白质是由许多氨基酸通过肽键相连形成的高分子含氮化合物。

4、  蛋白质能做为药物的原因：（1）作为生物催化剂；（2）代谢调节作用；（3）免疫保护作用；（4）物质的转运和储存；（5）运动与支持作用；（6）参与细胞间信息传递。

5、  蛋白质元素组成特点：各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16%。

6、  氨基酸的性质：两性解离和等电点；光学性质；重要化学反应：（1）与茚三酮反应：用于氨基酸定量定性测定；（2）（Sanger反应）与DNFB反应用于N端测定。（3）Edman反应：与PITC反应用于N端测序，蛋白质测序仪设计原理的依据。

7、  蛋白质的一级结构：指多肽链中氨基酸的排列顺序，主要的化学键包含肽键，部分蛋白质含有二硫键。

8、  蛋白质的二级结构：指蛋白质分子空间的三维结构，既立体空间的构象，在蛋白质分子中各元素围绕某些化学键进行旋转，从而形成各种空间排布及相互关系。

9、  肽键平面是蛋白质的基本结构单位：参与肽键的6个原子：C1，C，O，N，H，C2位于同一平面，此同一平面上6个原子构成了所谓的肽单元。

10、           二级结构：一条多肽链中局部原子的空间排布；二级结构的基本形式：（1）a-螺旋；（2）β－折叠；（3）β－转角；（4）无规卷曲；

11、           无规卷曲是用来阐述没有规律性的那部分肽链结构。是相对没有规律性的排布，但是其同样表现重要的生物学功用；二级结构的维系力：氢键。

12、           蛋白质二级结构是以一级结构为基础的。一段肽链的氨基酸残基的侧链适合形成a－螺旋或β－折叠，它就会出现相应的二级结构。

13、           蛋白质的三级结构：一条多肽链中全部氨基酸残疾（或全部元素）的空间相对位置。既肽链中所有原子在三维空间的排布位置。包括主链，侧链的全部内容。主要的化学键：氢键、离子键、疏水键、范德华力等。

14、           蛋白质的四级结构：有些蛋白质含有两条或多条肽链，每一条都有完整的三级结构，称为蛋白质的四级结构，每条肽链称为亚基。（蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构。维系亚基之间的结合力有：疏水键、范德华力以及氢键和离子键，还有二硫键。

15、           当蛋白质溶液在某一定ph值时，使某特定蛋白质分子上所带正负电荷相等，成为两性离子，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的ph值即为该蛋白质的等电点pi。

16、           由于蛋白质的分子量很大，在水溶液中形成1－100nm的微粒，因而具有胶体溶液的特征。可溶性蛋白质分子表面分布着大量极性氨基酸残疾，对水有很高的亲和性，通过水合作用在蛋白质颗粒外面形成一水化层，同时这些颗粒带有电荷，因而蛋白质溶液是相当稳定的亲水胶体。

17、           如果加入适当的试剂使蛋白质分子处于等电点状态或失去水化层（消除相同电荷，除去水膜），蛋白质胶体溶液就不再稳定并将产生沉淀。

18、           沉淀方法类别：（1）高浓度中性盐(盐析、盐溶）；（2）酸碱等电点沉淀；（3）有机溶剂沉淀；（4）重金属盐沉淀；（5）生物碱试剂和某些酸类沉淀；（6）加热变性沉淀。

19、           蛋白质变性与复性：蛋白质各自特有的高级结构；是表现其物理性质和化学特性以及生物学功能的基础。当天然蛋白质受到某些物理因素和化学因素的影响，使其分子内部原有的高级构象发生变化时，蛋白质的理化性质和生物学功能都随之改变或丧失，但并未导致其一级结构的变化，这种现象称为变性作用。表征：生物活性丧失；物理性质和化学性质改变。

20、           蛋白质主要呈色反应：双缩脲反应；福林酚试剂反应；茚三酮反应；蛋白质定量，定性的常用测定方法。

21、           蛋白质在远紫外光区（200－230nm）有较大的吸收，在280nm有一特征吸收峰，可利用这一特性对蛋白质进行定性定量鉴定。

22、           蛋白质组成分析：（1）水解；（2）衍生：在游离氨基酸残疾上衍生一个生色基团；（3）色谱。最终获得蛋白质或多肽中各氨基酸所占摩尔分数或摩尔比。

23、           酸性水解：得到的氨基酸不消旋，但天冬酰胺、谷氨酰胺分别被完全水解为天冬氨酸和谷氨酸，色氨酸则被完全破坏，半胱氨酸不能从样品中直接测定，酪氨酸部分被水解液中恒量杂质所破坏，丝氨酸和苏氨酸被部分水解。

24、             对某些氨基酸的破坏率、需要用不同的水解时间测定这些氨基酸的含量，然后外推到水解时间0H，算得的氨基酸含量，即代表了真正数值。

25、             有些脂肪族氨基酸残基间的肽键难于裂解，可通过延长水解时间来解决。但长时间的水解会使较敏感的氨基酸残基损失更大。

26、             半胱氨酸和甲硫氨酸往往先将蛋白质用过甲酸氧化后再水解，相应得到磺基丙氨酸和甲硫氨酸。

27、             碱性水解：多数氨基酸遭到破坏，其它氨基酸消旋，仅色氨酸稳定。所以此法仅限于测定色氨酸的含量。

28、             酶水解：用一组蛋白酶水解肽链，特别适用于对化学水解敏感的氨基酸如天冬酰胺和谷氨酰胺的测定。优点是水解过程中氨基酸不发生消旋化，几乎可以保持所有的组成氨基酸不被破坏。缺点是反应需要较长时间，水解的产物为较小的肽段，水解不完全。另外，酶本身也是蛋白质，对样品的结果测定可能会有干扰。

29、             微波辐射能水解：微波是一种高频电磁波，其能量传递是通过分子的极化，而水分子的极化作用是非常高的，微波能量的快速吸收能导致完全水解的时间大大缩短。在微波辅助酸水解和酶水解中，水解时间可从几十小时缩短至几十分钟。

30、             膜上蛋白质印迹样品的水解（原位分析）：如果蛋白质样品采用电泳法分离，很难从凝胶中洗脱下来，可采用电印迹法把样品转移到PVDF（聚偏氟乙烯）膜上，然后在PVDF膜上直接进行盐酸水解和氨基酸分析，称之为原位分析。

31、             色氨酸的保护：水解酸中添加保护剂：巯基乙酸和β－巯基乙醇。3mol/L巯基乙磺酸或4mol/L甲磺酸在水解时对色氨酸有一定保护作用。酶：利用蛋白酶作为水解剂，条件温和，对天冬氨酸和谷氨酰胺及色氨酸均无破坏作用。碱：用氢氧化钠或氢氧化钡代替酸水解，可保护色氨酸不被破坏。

32、             半胱氨酸的保护：还原烷化法：产生能抗水解的半胱氨酸衍生物。烷化试剂包括40乙烯吡啶和碘代乙酸。缺点：为了确保试剂接近巯基，还原和氧化通常要在变性剂存在下进行，多余试剂盒变性剂要用HPLC、沉淀法或透析去除，没一步都可能造成样品的损失。

33、             氧化反应：过甲酸氧化反应被用来转化半胱氨酸和胱氨酸称为半胱氨酸再进行测定。缺点：会影响其他氨基酸特别是甲硫氨酸会转变成加硫氨酸砜，酪氨酸会降解。必须准备能分析两次的样品量，一次提供半胱氨酸数据，另一次则提供其他氨基酸的组成数据。

34、             衍生是将氨基酸衍生为有利于测定或分离的化合物。大多数氨基酸不含有芳香环等生色团，无法直接用紫外法检测，需要先将氨基酸衍生为具有较强紫外或荧光吸收的衍生物。从衍生角度看，氨基酸分析可分为柱前衍生和柱后反应法两大类。

35、             柱后反应法：将游离氨基酸经过色谱柱分离后，各种氨基酸再与显色剂作用。优点：比较稳定，对样品预处理要求低，容易定量和自动化操作。缺点：检测灵敏度不高，分析时间长。

36、             柱前衍生法：将氨基酸和化学偶联试剂先反应生成氨基酸的衍生物，然后再用色谱柱将各种衍生物分离，直接检测衍生物的光吸收或荧光发射。优点：分析灵敏度高，可用HPLC进行氨基酸分析。缺点：有点衍生物不稳定，衍生试剂可能干扰氨基酸检测。

37、             几种常见的氨基酸衍生化方法：（1）茚三酮反应；（2）荧光胺法；（3）邻苯二甲醛法（OPA）；（4）PTC－AA法；（5）DNS－CI法；（6）硫酰氯二甲胺偶氮苯法。

38、             氨基酸的定性和定量分析一般用：纸层析；双向纸层析；薄层层析；HPLC；离子交换层析柱等方法。

39、             蛋白质的末端测定：

40、             N端分析方法：二硝基氟苯法；二甲氨基萘磺酰氯法；异硫氰酸苯酯法；DABITC法，氨肽酶法。

41、             二硝基氟苯在弱碱性条件下，与肽链的N端氨基作用，形成二硝基苯基肽链（DNP—肽）经酸水解后，N端残基成为二硝基苯基－氨基酸，可用有机溶剂（如乙醚）抽提，再进行纸层析或薄层层析后，根据层析斑点的位置作定性鉴定。

42、             FDNB还可以与侧链上的基团反应，但水解后产物极性较强，不被乙醚抽提。当N端氨基是脯氨酸或羟脯氨酸时，不能进行测定。

43、             DNS－CL法：荧光剂DNS－CI可与肽链N端氨基反应生成DNS－肽，经酸水解，N－末端残基形成DNS－氨基酸，用乙酸乙酯抽提，然后用层析法鉴定。DNS－氨基酸于360nm和280nm处产生强烈荧光，根据荧光点位置确定N端氨基酸。

44、             PIT－氨基酸在268nm处有强吸收峰

45、             DABITC能与N端氨基反应生成DABTH－氨基酸，经层析分离后，用盐酸气熏即可出现红色斑点，很容易鉴定。

46、             C端测定：羧肽酶法，硼氢化锂法（与C端氨基反应后生成相应的a－氨基醇，水解后抽提氨基醇，可用层析法分离鉴定。），肼解法。

47、             封闭N－末端测定：没有游离的氨基端

48、             乙酰化N端：肼解条件下，N端的乙酰基形成乙酰肼，然后使其与DNS－CI作用，形成N乙酰－N’－丹磺酰肼经乙醚抽提后可应用薄层层析等方法鉴定；吡咯烷酮羧酸末端：牛肝焦谷氨酸氨肽酶能水解出末端的吡咯烷酮羧酸，从而使剩下的有自由氨基端的肽链可以用Edman方法递减分析。甲酰基末端：存在于原核体系的初生肽链的端部。弱酸条件下处理48小时即可。

49、             二级结构测定：采用圆二色谱测定溶液状态下的蛋白质二级结构含量。

50、             三级结构测定：X射线衍射法和核磁共振技术是研究蛋白质三维结构最准确的方法

51、             蛋白质药物质量控制的要点：（1）蛋白质纯度检查；（2）蛋白质含量测定；（3）蛋白质药物理化性质的鉴定；（4）残余杂质检测。

52、             蛋白质纯度检查：世卫组织规定必须用HPLC和非还原SDS－PAGE两种方法测定，其纯度都应达到95%以上才能合格；纯度的检测通常是在原液中进行。

53、             从蛋白制剂中检测出少量的污染蛋白质是很困难的。因为污染蛋白质的量很可能低于很多测定方法的检测下限。制剂中往往含有大量的辅料。当用一种方法测定蛋白质纯度时，可能有两种或更多的蛋白质表现出相似的行为。这种类似的行为可能会导致本来是混合物的样品也被认为是均一物质的错误结论。只用一种方法作为纯度试验的标准是很不可靠的，必须选择多种测定纯度的方法。最好的纯度标准是建立多种分析方法，从等电点、相对分子质量、疏水性等不同的角度来证明了蛋白质样品的均一性。纯度最终取决于所用的方法的类型和分辨力，低分辨率的方法检测到结果改用高分辨率方法时就有可能证明它是不纯的。

54、             采用HPLC、非还原SDS－PAGE法测纯度。

55、             蛋白质含量测定：在质量标准中设定此项目主要用于原液比活性计算和成品规格的控制。蛋白含量采用福林酚试剂法（Lowry法）、染色法（Bradford法）、双缩脲法、紫外吸收法、HPLC法和凯氏定氮仪法。ELISA法。HPLC法。

56、             蛋白质药物理化性质的鉴定：

57、             （1）特异性鉴别试验：主要确定蛋白质的抗原性（2）免疫学方法：根据抗原抗体特异反应建立的方法。重组产品通常用免疫印迹和点免疫进行鉴定，特别当电泳出现两条或两条以上区带时则应该用免疫印迹进行鉴定。半干胶转移免疫印迹法是最常用的方法。印迹的效率取决于蛋白质从胶上转移到膜上的效率以及蛋白质与膜结合的效率。

58、             （2）相对分子量测定：还原型SDS－PAGE测定。质谱法。

59、             （3）等电点测定：可以表征药物的理化性质和纯度。均一的重组蛋白质只有一个等电点。常用的测定方法：等电聚焦电泳法（IEF）；毛细管电泳法：（CE）用紫外检测，适用于某些不易染色的蛋白质多肽。

60、             （4）肽图分析：测定一级结构，工艺稳定性。肽图裂解方法：（1）化学裂解法；（2）蛋白酶裂解法；（3）特殊处理：二硫键、空间构象较复杂的特殊产品。

61、             肽图常用的分析方法：（1）SDS－PAGE电泳；（2）反向HPLC；（3）毛细管电泳；（4）液质分析。

62、             吸收光谱：某一重组蛋白来说，其最大吸收波长是固定的。在生产过程中没批产品的紫外吸收光谱应当是一致的。

63、             氨基酸组成分析：是结构分析的辅助手段，质量控制的重要指标。在生产的控制中，样品的氨基酸组成结果应与标准品一致。

64、             N和C端氨基酸测序，必须测N端15个氨基酸，C端应测1－3个。