项目文章 | 欧易单细胞测序助力解析阿兹海默症B细胞分子标志物

欧易单细胞测序助力解析阿兹海默症B细胞分子标志物！2021年12月8日，四川大学华西医院王廷华课题组与遵义医科大学附属医院神经内科余昌胤课题组协作，利用单细胞测序在Experimental & Molecular Medicine发表了AD分子标志物相关成果，欧易生物提供了该篇文章的测序和分析服务。

  研究背景  

阿兹海默症（Alzheimer’s disease，AD）一直是医学界的一大难题，给老龄化人口带来持续负担。根据统计数据显示，全世界约有5000万人患有AD或其他形式的痴呆症。目前，AD可通过神经心理检查、血液检查、神经影像学检查、基因检查等进行诊断。过去几年中，国际工作组将生物标志物整合到诊断过程中，并于2014年开始将AD生物标志物划分为诊断标志物和进展标志物，以覆盖疾病的所有阶段（从无症状状态到痴呆最严重阶段）。已有报道，外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）在多种神经退行性疾病中发挥促进作用。

  文章信息  

文章题目：Single-cell RNA sequencing reveals B cell–related molecular biomarkers for Alzheimer’s disease

发表期刊：Experimental & Molecular Medicine

样本类型：4例AD患者（2例早期，2例晚期）和2例正常对照的PBMCs

组学技术：scRNA-seq（共获得46244个细胞）

影响因子：8.75

  文章简介  

本文通过对4例AD患者（2例早期，2例晚期）和2例正常对照的PBMCs进行scRNA-seq分析，发现AD患者血液中B细胞明显减少。通过流式分选检测43例AD患者和41例正常人的PBMCs，发现B细胞减少与患者的临床痴呆评分（Clinical Dementia Rating, CDR）密切相关。为了证实B细胞在AD进展中的作用，作者对AD早期小鼠进行功能性实验，实验中小鼠纤维斑块开始出现。结果表明，在AD早期，B细胞耗竭明显加速并加重了AD小鼠的认知功能障碍和脑内淀粉样肽负荷（Aβ负荷）。更重要的是，随着疾病进展，B细胞中有18个基因特异性上调，7个基因特异性下调，其中一些基因与AD密切相关，使B细胞预测AD严重程度成为可能，有助于识别临床AD进展。

 研究结果  

1. scRNA-seq分析PBMCs异质性

MRI扫描显示，与正常个体相比，晚期AD患者出现脑萎缩和心室扩张（图1a）。6个样品中N1、N2、EA1、EA2、LA1、LA2分别获得7906、6842、6957、3648、9959和10932个高质量细胞（图1b）。利用高变量基因的平均表达值计算Pearson相关系数，可视化数据集的组间变异性，相关值从0.8101到0.9496，显示样本间细胞类型分布的高一致性（图1c-d）。

图1 单细胞RNA-seq分析样本PBMCs异质性

2. 验证AD患者PBMCs亚群差异

对6个细胞亚群差异表达基因的KEGG分析表明，上调基因主要富集在造血细胞系、成骨细胞分化和T细胞受体等信号通路，下调基因主要富集在RNA转运、FoxO信号通路、TNF信号通路、凋亡、鞘脂信号通路和mRNA监视通路（图2a-b）。将PBMCs分成6个细胞类型（图2c），在AD早期和晚期患者的PBMCs中，B细胞百分比较正常对照组明显降低（图2d-f）。

图2 AD患者PBMCs细胞亚群差异

3. 分析AD患者PBMCs细胞亚群的基因表达谱

聚类分析每个细胞类型基因表达，计算AD不同阶段的基因表达差异（图3a）。每个细胞亚群中差异表达的基因，根据其随着疾病发展的表达趋势分为上调基因和下调基因（图3b）。对各细胞类型的差异表达基因进行KEGG分析，发现B细胞、CD8+ T细胞和NK细胞上调的基因在AD中均表现出富集；top 5富集信号通路中，在B细胞中富集最多（图3c）。

图3 AD患者PBMCs亚群基因表达谱

4. 分析B细胞中差异表达基因

利用TBtools制作的维恩图发现6个不同细胞类型中特异性上调和下调基因的数量，除重叠区域外，B细胞中特异性上调基因有361个，下调438个；CD4+T细胞中特异性上调基因有108个，下调724个；CD8+T细胞中特异性上调基因有176个，下调278个（图4a-b）；并发现在B细胞中特异性上调或下调的基因在其他细胞亚群中没有明显变化（图4c-d）。根据AD纳入标准，作者收集了43例AD患者和41例正常受试者的PBMCs（图4f），发现AD患者的T细胞（23.9%）和B细胞（3.37%）分别少于正常对照组（36.9%和8.54%）（图4g）。B细胞数量与CDR评分相关性分析表明，B细胞数量与AD的严重程度呈负相关；即B细胞越少，AD发展越严重（图4h-j）。基于这些发现，确定B细胞为AD的特异性生物标志物。

图4 B细胞差异基因

5. B细胞缺失导致AD小鼠认知功能下降

为了进一步验证B细胞在AD进展中的作用，作者对16周龄的AD小鼠进行B细胞衰竭实验（B cell depletion treated，BCDT）。连续进行3个月后，作者采用开放场试验、Morris水迷宫试验和Y迷宫试验评价小鼠认知功能，结果发现与无痴呆的WT小鼠相比，认知功能障碍最严重的是AD + BCDT小鼠，其次是AD + PBS小鼠。

6. B细胞衰竭增加了AD小鼠大脑的Aβ沉积

免疫组化结果显示，与WT小鼠相比，AD小鼠海马和皮质淀粉样斑块负荷增加，而AD + BCDT小鼠比AD + PBS小鼠增加更明显。同时进一步明确了Aβ斑块在海马四个区域的分布，AD + BCDT小鼠的斑块数量高于AD + PBS小鼠（图5a-b）。

图5 B细胞耗竭对Aβ沉积的影响

7. 鉴定B细胞特异性差异基因

正常人和AD不同阶段患者中表达频率最高的 100个上调/下调基因中，有18/7个显著的基因相互作用网络复杂。在B细胞中，上调基因KIR3DL2、QPCT和PPP2R2B均参与神经功能和神经退行性疾病（图6a），下调基因FRAT2和WWC3参与Wnt/β-Catenin信号通路，与AD发病机制相关（图6b）。下调基因SPG20可介导线粒体钙稳态，线粒体钙稳态调节功能障碍可导致细胞内活性氧（Reactive oxygen species, ROS）积累，导致氧化应激，这是AD的早期特征之一。

从scRNA-seq数据进一步分析上述差异表达基因在B细胞中的表达，发现随着疾病的进展，KIR3DL2、QPCT和PPP2R2B在B细胞中的表达高于正常水平，SPG20、FRAT2和WWC3的表达低于正常水平（图6c-d）。同时作者发现AD早期和晚期B细胞中KIR3DL2和PPP2R2B的表达显著上调，而在其他细胞类型则不如此；随着AD的发展，WWC3和SPG20在B细胞中显著下调，单核细胞中PPP2R2B水平显著升高，而SPG20显著下降（图6e-f）。

图6 特征基因的鉴定和验证

 文章结论 

1. 通过单细胞RNA-seq分析，发现AD患者血液中B细胞明显减少；而通过流式分选，发现B细胞减少与患者的临床痴呆评分密切相关；

2. 在AD早期，B细胞耗竭加速并加重AD小鼠的认知功能障碍和Aβ负荷。随着疾病进展，B细胞中一些特异性上调和下调基因与AD密切相关；

3. 基于B细胞预测AD严重程度成为可能，这有助于识别临床AD进展。

 参考文献 

Xiong, LL., Xue, LL., Du, RL. et al. Single-cell RNA sequencing reveals B cell–related molecular biomarkers for Alzheimer’s disease. Exp Mol Med (2021).

 欧易生物单细胞事业部 

单细胞事业部建立于2018年，已成为欧易生物的核心部门之一。先后引入多套10x Genomics和 BD RhapsodyTM，流式细胞仪等主流的高通量单细胞分选平台，已获得10x Genomics公司授权的单细胞基因表达和空间转录组双平台服务提供商认证，并与北京、广州等地协同科研院所分别成立联合实验室。

团队成员50余人，博士学历5人，硕士及以上学历人员比例达40%以上；拥有300m2独立实验室，可完成样本处理、细胞分选、文库构建和空间转录等的实验。

单细胞事业部成立至今，已完成1000+个项目、6000+例样本的单细胞解离与测序，参与或协助客户发表近50篇高水平文章。欧易生物单细胞事业部致力于为广大科研工作者提供周到、贴心、专业的技术服务，专注于以客户的口碑铸就品牌形象。

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单细胞技术支持部  撰文

本文系欧易生物原创

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